材(cái)料與(yǔ)儀器

1. 緩(huǎn)衝液，溶液和試劑(jì)
去(qù)離子化(huà)的(dí)甲酰胺(àn)；焦碳酸(suān)二乙(yǐ)酯（DEPC) 處(chǔ)理(lǐ)過的(dí)水；消化緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)（lmol/L 異硫氰酸胍(guā),25 mmol/Lβ-巰基乙醇，0.5%N-月桂酰肌氨酸，20 mmol/LTris-HCl，pH7.5)；乙醇,100% 和(hé) 70%
；肝(gān)糖(táng)；異丙醇(chún)；苯(běn)酚 (pH4.3): 氯仿（70%:30%)；蛋白酶 K(60 mg/ml，20U/mg)；Trizol(Invitrogen)；二(èr)甲苯
2. 特(tè)殊設(shè)備
微量(liáng)離心(xīn)管(guǎn)，2 ml, 無(wú) RNA 酶
恒溫箱(xiāng)，預(yù)調(tiáo)至 37°C
水(shuǐ)浴(yù)或(huò)恒(héng)溫箱，預(yù)調(tiáo)至 55°C
3. 細(xì)胞(bāo)和(hé)組(zǔ)織(zhī)

石(shí)蠟包埋的(dí)組織樣品，切割為(wéi) 5~50 張 5um 厚的切片(piàn)

步驟

1. 將組織(zhī)塊置於(yú) 2.0 ml 微(wēi)量離(lí)心(xīn)管(guǎn)中，向樣品中加 1.8 ml 二(èr)甲(jiǎ)苯(běn)。37°C 溫育(yù) 20 min。
2. 稍微地離心(xīn)樣(yàng)品(pǐn)，移(yí)棄上清液再加入(rù)二(èr)甲(jiǎ)苯，重復溫(wēn)育和離心(xīn)步驟。
3. 用(yòng) 0.5 ml 乙酵(jiào)洗滌(dí)組(zǔ)織(zhī)。移棄乙(yǐ)醇(chún)，風幹(gān)。
4. 加(jiā) 80ul 蛋(dàn)白(bái)酶(méi) K(60 mg/ml，20U/mg) 和 72ul 消(xiāo)化(huà)緩衝液(yè)。55°C 下振蕩溫育過(guò)夜。
5. 再(zài)次(cì)加(jiā) 80ul 蛋白酶 K，55°C 下(xià)振蕩(dàng)溫(wēn)育過(guò)夜。次日(rì)再次加 80ul 蛋白酶(méi) K, 再次 55°C下振蕩(dàng)溫育過(guò)夜。
6. 加等(děng)體(tǐ)積(jī)酚：氯仿，混合，在微量(liáng)離心(xīn)機中以最大轉(zhuǎn)速離(lí)心 5 min。將液相(xiāng)轉移到RNA 酶(méi)的新管中。
7. 加(jiā)等體積(jī)異丙醇和 2ug 肝糖(táng)，-20°C 放(fàng)置 30 min。
8. 在微董離(lí)心機(jī)中以(yǐ)最大(dà)轉(zhuǎn)速(sù)離心 30 min。移棄上清(qīng)液(yè)，用(yòng) 70% 乙(yǐ)酵(jiào)洗滌(dí)沉降(jiàng)物。
9. 在微量離心(xīn)機(jī)中以最大轉(zhuǎn)速(sù)離心(xīn) 30 min 並(bìng)移棄(qì)上清(qīng)液。風幹(gān)沉(chén)降物(wù)，將之再溶(róng)解20ulDEPC 處(chǔ)理(lǐ)過(guò)的水中。加(jiā) 500ulTrizol。遵循(xún) Trizol 方案(àn)（見(jiàn)本章方(fāng)案(àn) 3)，對(duì)一(yī)處做修改：在第一(yī)次 Trizol 處理後(hòu)，將(jiāng)液(yè)相(xiāng)轉(zhuǎn)移(yí)到無 RNA 酶的(dí)新(xīn)管中(zhōng)，用 500ulTrizol 第(dì)二(èr)次處(chǔ)理樣品。
10. 向第二(èr)次 Trizol 處理過(guò)的液相加 500ul 異丙(bǐng)醇以(yǐ)沉澱(diàn) RNA。
11. 將(jiāng) RNA 沉降物(wù)再(zài)溶(róng)解於 20ul 去離子(zǐ)甲(jiǎ)酰胺中(zhōng)。-20°C 儲(chǔ)存(cún) RNA。

天(tiān)津益元利康(kāng)生(shēng)物(wù)科技有限公司(sī)提供(gōng)，更多(duō)有(yǒu)關(guān)RNA提取實驗(yàn)產(chǎn)品和(hé)資料(liào)，請(qǐng)聯係(xì)益元利(lì)康(kāng)客(kè)服(fú)！