材料與儀器(qì)

LCM 帽子(zǐ)
乙醇(chún) 糖(táng)原 RNA 提(tí)取試劑盒 超(chāo)純水(shuǐ)
移(yí)液器(qì)

步(bù)驟(zhòu)

一，材(cái)料(liào)
1. 緩衝(chōng)液(yè)，試劑和溶液
75% 乙醇(chún) (超純(chún)水配(pèi)製）
糖原，5 mg/ml(Ambion，Austin，TX)
StratageneRNA 提(tí)取試(shì)劑(jì)盒（200345，StratageneCloningSystems，LaJolla,CA)，
包括(kuò)變(biàn)性(xìng)溶(róng)液，飽(bǎo)和酚(fēn) (存(cún)於(yú) 4°C)，β-巰(qiú)基乙醇 (存(cún)於(yú) 4°C)，氯仿：異(yì)戊(wù)醇，
2mol/L 乙(yǐ)酸鈉(nà)，異(yì)丙醇(chún)。或(huò)者(zhě)使用 PicoPureRNA 分離試劑盒(hé)（KIT0202，Arcturus，
MountainView,CA)
DEPC 處(chǔ)理的超(chāo)純(chún)水(shuǐ) (BiotecxLaboratories，Houston，TX)(4°C 儲(chǔ)存(cún)）
2. 特(tè)殊設(shè)備
移(yí)液器(qì)
無 RNA 酶(méi)的(dí) 1.5 ml 管子
3. 細胞(bāo)和(hé)組織
來自(zì)方(fāng)案(àn) 3 的 LCM 帽子
二，方法(fǎ)
1. 加入 200ul 變性溶(róng)液和(hé) 1.6ulβ-巰基乙(yǐ)醇(chún)到 0.5 ml 管子(zǐ)中。
2. 將(jiāng) LCM 帽子插入管(guǎn)子，渦旋 5s。
3. 倒置(zhì)管(guǎn)子孵(fū)育(yù) 5 min。
4. 移去 LCM 帽子。這一步獲得的(dí)樣(yàng)品可以(yǐ)在(zài)-80°C 保(bǎo)存 6 個月(yuè)。
5. 將溶液轉(zhuǎn)移到(dào) 1.5 ml 管子(zǐ)中。
6. 加(jiā)入 2ul2mol/L 的(dí)乙酸鈉，溫(wēn)和混匀。
7. 加入 220ul 水(shuǐ)飽和的酚(fēn)（底(dǐ)層），溫和混(hùn)匀(yún)。
8. 加(jiā)入 60ul 氯(lǜ)仿(fǎng)：異(yì)戊醇，劇烈晃動。
9. 放(fàng)於冰上 15 min。
10.14000r/min4°C 離(lí)心 30 min。
11. 吸上層(céng)溶液到新管子中(zhōng)。
12. 加(jiā)入(rù) 2ul 糖(táng)原（最(zuì)終濃(nóng)度 10~150ug/ml)。
13. 加入 200ul 冷異丙(bǐng)醇(chún)。
14.-80°C 過夜。

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