離心(xīn)柱(zhù)法主要是(shì)利用離心(xīn)柱中(zhōng)的(dí)矽(guī)膠基質吸附RNA，再通過(guò)洗滌去(qù)除雜(zá)質(zhì)從而(ér)得到RNA的一種(zhǒng)常用方法(fǎ)。相較(jiào)於Trizol法(fǎ)，離心柱(zhù)法因(yīn)操(cāo)作(zuò)簡便，耗(hào)時短，純(chún)度高等(děng)優點而得(dé)到(dào)廣(guǎng)泛應(yīng)用(yòng)，但(dàn)也(yě)因其吸附柱規(guī)格的(dí)限(xiàn)製在大(dà)批量操(cāo)作時(shí)具有一(yī)定的局(jú)限(xiàn)性(xìng)，此外，針對(duì)特殊(shū)的(dí)樣(yàng)本，其(qí)提(tí)取(qǔ)的(dí)效(xiào)果(guǒ)也(yě)大(dà)不(bù)如Trizol法好。那麼你(nǐ)知(zhī)道柱式法RNA提取(qǔ)的實(shí)驗(yàn)流程(chéng)和(hé)注意(yì)事(shì)項(xiàng)是什(shí)麼嗎？讓我們一(yī)起來(lái)看看吧！
 

　　一(yī)，主要(yào)的試(shì)劑，儀器(qì)與(yǔ)耗材
 

　　RNA提(tí)取試劑盒(hé)，氯仿，無(wú)水乙(yǐ)醇(chún)，RNase free Water，低溫冷凍離(lí)心(xīn)機，匀漿器(qì)或(huò)組織研磨器(qì)，微(wēi)量(liáng)移(yí)液(yè)器(qì)，通(tōng)風櫥，計(jì)時器，1.5ml EP管(guǎn)，2ml EP管等(děng)。
 

　　二(èr)， 提取(qǔ)步驟
 

　　1.樣(yàng)品(pǐn)處(chǔ)理(lǐ)：
 

　　· 細(xì)胞(bāo)：貼(tiē)壁(bì)細胞每106細胞(bāo)加(jiā)入1ml裂(liè)解液，吹(chuī)打混(hùn)匀(yún)。
 

　　· 懸(xuán)浮細胞(bāo)：植物(wù)，動物，酵母每10^6細胞加入(rù)1ml裂解液。
 

　　· 細菌(jūn)細胞每(měi)107細胞(bāo)加(jiā)入(rù)1ml裂(liè)解液(yè)混匀(yún)。
 

　　· 組織(zhī)：新鮮或-70℃凍(dòng)存100mg組(zǔ)織加(jiā)1ml裂(liè)解(jiě)液(yè)，匀漿(jiāng)處理(lǐ)。
 

　　2.室溫(wēn)放置(zhì)5min，使核酸(suān)蛋白復(fù)合(hé)物(wù)分離；
 

　　3.向匀(yún)漿樣(yàng)品(pǐn)中加入(rù)0.2ml的氯仿(fǎng)，蓋好管蓋(gài)，劇(jù)烈(liè)振蕩15s，室溫(wēn)放(fàng)置(zhì)3-5min；
 

　　4.2-8℃，12000rpm離心10min。RNA主(zhǔ)要存在(zài)於上層水(shuǐ)相(xiāng)中把(bǎ)水相轉(zhuǎn)移至新的(dí)EP管(guǎn)中(zhōng)(注：不(bù)可吸到沉(chén)澱)；
 

　　5.吸(xī)附柱前(qián)處(chǔ)理：在吸附柱(zhù)中加入(rù)500ul洗柱液，室溫(wēn)放置2min，2-8℃，12000rpm離(lí)心(xīn)2min，棄廢(fèi)液(小Tips：此步可(kě)以在第(dì)四(sì)步離心(xīn)還剩(shèng)2min左(zuǒ)右的時候(hòu)進行，這樣第四步(bù)離心(xīn)結(jié)束就(jiù)可以直(zhí)接(jiē)進行(háng)洗柱(zhù)，而不需要(yào)再等(děng)時間)；
 

　　6.在收集的上(shàng)清中(zhōng)加(jiā)入(rù)200ul無水(shuǐ)乙(yǐ)醇(chún)混(hùn)匀，加入吸附(fù)柱中(zhōng)靜置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄(qì)廢液(yè)；
 

　　7.向(xiàng)吸(xī)附柱(zhù)中加(jiā)入600ul漂(piāo)洗液(yè)(注：新買的(dí)試劑盒(hé)中漂洗液還需(xū)要加(jiā)入(rù)一(yī)定量(liáng)的無水乙醇，此步一定要(yào)確(què)認(rèn)漂(piāo)洗(xǐ)液是(shì)否加(jiā)入無水(shuǐ)乙醇)，2-8℃，12000rpm離心2min，棄(qì)廢液；
 

　　8.向(xiàng)吸附柱(zhù)中(zhōng)加(jiā)入600ul漂(piāo)洗(xǐ)液(yè)，2-8℃，12000rpm離(lí)心2min，棄廢液(yè)(注：漂(piāo)洗液在7-8步共(gòng)加(jiā)了(liǎo)兩次(cì)哦)；
 

　　9.12000rpm離心(xīn)2min，棄掉收(shōu)集(jí)管，將(jiāng)吸(xī)附(fù)柱(zhù)置於(yú)室溫(wēn)數分鐘(10-15min)以去除殘留(liú)的漂(piāo)洗液(注：最好(hǎo)在通風櫥進(jìn)行，以(yǐ)免RNA酶對(duì)RNA的(dí)降解；通(tōng)風櫥在(zài)使(shǐ)用前(qián)也(yě)可(kě)先(xiān)紫外30min)；
 

　　10.將吸(xī)附(fù)柱(zhù)放(fàng)入(rù)新管(guǎn)中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O(通(tōng)常取(qǔ)中(zhōng)間(jiān)值(zhí))，室(shì)溫放(fàng)置(zhì)5min，12000rpm室(shì)溫(wēn)離心2min即(jí)可(kě)得(dé)到RNA溶液(yè)(注(zhù)：所(suǒ)有(yǒu)步驟中(zhōng)僅最後一步離心(xīn)是在室溫(wēn)，其(qí)餘(yú)均在2-8℃，因(yīn)此，前幾(jī)步離心(xīn)拿出樣品後(hòu)一定要(yào)及時關上(shàng)離(lí)心機蓋(gài)子，以免升溫，而在第9步離(lí)心結束後(hòu)就可(kě)以打開(kāi)離心機蓋(gài)子使其(qí)快(kuài)速(sù)升至室溫)。
 

　　三(sān)， 注意(yì)事(shì)項
 

　　1.佩戴手套，口罩，消毒操(cāo)作台，杜(dù)絕(jué)外源酶的(dí)汙染(rǎn)；
 

　　2.所用試(shì)劑(jì)耗(hào)材(cái)必(bì)須(xū)無酶(méi)化，有條件(jiàn)者可(kě)以(yǐ)直接(jiē)購買(mǎi)，否(fǒu)則(zé)就(jiù)要做好(hǎo)高(gāo)壓滅(miè)菌(jūn)的工(gōng)作；
 

　　3.得(dé)到(dào)RNA溶(róng)液後(hòu)可(kě)保(bǎo)存於-80℃，避免(miǎn)反復凍融，放置(zhì)時間不可過長；4.對於(yú)組織RNA的(dí)提取，一(yī)定要(yào)充(chōng)分匀漿(jiāng)處理以(yǐ)使(shǐ)RNA充分(fēn)釋(shì)放(fàng)出來。
 

　　更多有關柱式法RNA提(tí)取(qǔ)的(dí)實驗流程和注(zhù)意(yì)事項(xiàng)，請(qǐng)聯(lián)係天津益元利康生(shēng)物科(kē)技有限(xiàn)公(gōng)司。