原(yuán)代細胞分離培養是一項實驗(yàn)技術
，它(tā)涉(shè)及(jí)從生物體(tǐ)中提(tí)取組(zǔ)織(zhī)或細(xì)胞(bāo)
，並將(jiāng)它(tā)們轉(zhuǎn)移(yí)到體外(wài)環境中(zhōng)進(jìn)行(háng)培(péi)養。這(zhè)些(xiē)來源包(bāo)括各(gè)種組(zǔ)織器(qì)官，外周(zhōu)血和胚(pēi)胎等(děng)。在培(péi)養(yǎng)過(guò)程(chéng)中
，原(yuán)代細胞的生長(cháng)速(sù)度相(xiāng)對較(jiào)慢
，通(tōng)常(cháng)在(zài)培養的(dí)前(qián)10代(dài)內(nèi)停(tíng)止生(shēng)長。因此
，通常(cháng)將(jiāng)培養(yǎng)的細胞(bāo)歸類(lèi)為原代(dài)細胞(bāo)培(péi)養
，這些細胞包括(kuò)第1到第10代(dài)的細(xì)胞(bāo)。下(xià)麵讓我們一起來看看(kàn)原(yuán)代細胞分離(lí)的(dí)注意事(shì)項與(yǔ)常(cháng)見問題(tí)吧！
 

　　一(yī)，常見問題(tí)：
 

　　1. 保(bǎo)存(cún)血清的方法是什(shí)麼
？
 

　　建議(yì)將血(xiě)清存(cún)放在(zài) -5℃ 至(zhì) -20℃的(dí)溫度(dù)範圍內。如(rú)果(guǒ)存放在4℃
，請(qǐng)不要超過(guò)一個月。如果無法一(yī)次使(shǐ)用(yòng)完(wán)整(zhěng)瓶(píng)血清(qīng)
，建議(yì)將(jiāng)血清經過無(wú)菌分(fēn)裝後存(cún)放(fàng)在適當(dāng)的滅菌(jūn)容器中
，然(rán)後再(zài)放(fàng)回(huí)冷凍(dòng)。
 

　　2. 如何解凍(dòng)血清以保(bǎo)持其最佳培養狀態
？
 

　　建議(yì)將(jiāng)血清(qīng)從冷(lěng)凍(dòng)箱中(zhōng)取(qǔ)出後(hòu)
，首先放置在2～8℃的冰箱(xiāng)中使其(qí)融化
，然(rán)後在室(shì)溫(wēn)下(xià)使(shǐ)其融(róng)化。但(dàn)務必要注意
，在(zài)融(róng)解過程中(zhōng)必須規律地(dì)搖晃以確(què)保均匀(yún)。
 

　　3. 血清解凍(dòng)後(hòu)發(fā)現有(yǒu)絮狀沉澱物(wù)出(chū)現
，應該(gāi)如(rú)何(hé)處理
？
 

　　血清中(zhōng)出(chū)現(xiàn)沉澱(diàn)物有很(hěn)多原因
，但(dàn)最(zuì)常見的是由(yóu)於血清(qīng)中脂蛋(dàn)白(bái)的(dí)變性所致。此(cǐ)外(wài)
，血清(qīng)解凍後血纖維(wéi)蛋白(bái)的(dí)存(cún)在也(yě)可能導致(zhì)沉澱(diàn)物的生成(chéng)。
 

　　1. 通(tōng)過(guò)使C57BL/6小(xiǎo)鼠頸椎脫(tuō)臼死亡(wáng)
，然(rán)後用適量(liáng)的酒(jiǔ)精噴灑(sǎ)和Buffer滴加的方式
，快(kuài)速分離結腸(cháng)。
 

　　2. 沿著(zhuó)腸(cháng)係膜(mó)進行剪開
，利用(yòng)DMEM培養基清(qīng)洗結(jié)腸
，以去(qù)除(chú)其中(zhōng)的腸(cháng)腔(qiāng)內容物。
 

　　3. 使用(yòng)無(wú)菌(jūn)剪刀(dāo)將結腸(cháng)組織剪成(chéng)約1mm³大(dà)小的碎片。
 

　　4. 使(shǐ)用10 mL 0.1%膠(jiāo)原酶(méi)I和3%分(fēn)散(sàn)酶II對組(zǔ)織進行消化(huà)
，在(zài)37℃的搖(yáo)床上(shàng)消化25分(fēn)鐘。
 

　　5. 進行(háng)吹打(dǎ)混匀
，並通過100μm細(xì)胞(bāo)過(guò)濾(lǜ)器(qì)過(guò)濾
，以(yǐ)收(shōu)集(jí)上(shàng)清液(yè)。
 

　　6. 采(cǎi)用(yòng)相差消(xiāo)化(huà)法(fǎ)和差(chà)速貼壁法(fǎ)去除(chú)成纖維細(xì)胞。
 

　　7. 加入(rù)1 mL培養基
，將細胞(bāo)懸(xuán)浮後接種(zhǒng)於含有(yǒu)培養基的培養瓶中
，在37℃，5% CO2的細胞(bāo)培(péi)養(yǎng)箱中培(péi)養(yǎng)。
 

　　8. 當細胞生長至(zhì)培養瓶的80-90%時
，使用(yòng)5 g/L胰(yí)酶(méi)消(xiāo)化(huà)液(yè)進(jìn)行消(xiāo)化
，然後(hòu)將(jiāng)其(qí)接種(zhǒng)於(yú)細(xì)胞(bāo)培養(yǎng)板(bǎn)中。
 

　　二(èr)，注意事(shì)項：
 

　　原(yuán)代細(xì)胞(bāo)培(péi)養具有(yǒu)較高的成本(běn)
，並對培養條件(jiàn)有嚴(yán)格要求(qiú)。因此
，在培(péi)養過程(chéng)中需要(yào)特別注意保(bǎo)持(chí)無菌(jūn)環境
，並(bìng)盡可能(néng)去除(chú)目(mù)標(biāo)細胞以外的其他細(xì)胞。
 

　　1. 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前
，必須對(duì)所(suǒ)有器(qì)械進行消毒(dú)處理
，並進(jìn)行高壓滅(miè)菌(jūn)
，液體則(zé)需要進(jìn)行無(wú)菌(jūn)過(guò)濾(lǜ)處(chǔ)理。
 

　　2. 酶(méi)消(xiāo)化液必(bì)須立即(jí)現(xiàn)用現(xiàn)配(pèi)
，以確(què)保(bǎo)其(qí)活(huó)性。
 

　　3. 在(zài)實(shí)驗過程中
，需要充分消(xiāo)化(huà)組織以(yǐ)確(què)保檢測到(dào)足(zú)夠數量的細(xì)胞(bāo)。
 

　　4. 同時
，也要(yào)盡(jìn)可能充分去除成(chéng)纖(xiān)維(wéi)細胞(bāo)。
 

　　5. 在(zài)後(hòu)續(xù)的培(péi)養過程中(zhōng)
，必須保持(chí)全程(chéng)無(wú)菌(jūn)操(cāo)作(zuò)
，以(yǐ)確保(bǎo)培養環(huán)境的純淨性(xìng)。
 

　　更(gēng)多有關(guān)原代細胞分(fēn)離(lí)的(dí)注意事(shì)項與常(cháng)見問(wèn)題(tí)
，請(qǐng)聯(lián)係(xì)天津益元利(lì)康生物(wù)科(kē)技有限公司(sī)。