材料(liào)與儀器(qì)

1. 細(xì)胞和組織(zhī)
細胞/組織(zhī)，凍於(yú)液氮

2. 緩衝液，溶液(yè)和試(shì)劑(jì)
氯仿
氯(lǜ)化(huà)銫(sè)溶液，5.7mol/L(5.7mol/L 氯(lǜ)化銫，25 mmol/L 醋酸(suān)鈉(nà)，pH6.0，1mmol/LEDTA,pH8.0)
用焦碳酸二(èr)乙(yǐ)酯(zhǐ)（DEPC) 處理(lǐ)過的水
二(èr)硫(liú)蘇糖醇（DTT)，0.2 mmol/L
EDTA,1mmol/L，pH8.0
乙醇，70%(體積分數）
異硫氰酸(suān)胍裂解(jiě)緩衝液 (4mol/L 異(yì)硫氰(qíng)酸胍(guā)，25 mmol/L 醋酸(suān)鈉，pH6.0,1mmol/LEDTA,pH8.0)
異丙醇
N-月桂(guì)酰(xiān)肌(jī)氨酸，20%（200 g/L)
氯化鋰（LiCl),8mol/L
液氮
β-巰基乙醇,10 ml/L
苯(běn)酚, 水飽和(hé)，pH4.0
3. 離心機和(hé)轉(zhuǎn)子(zǐ)
BeckmanTi50 轉(zhuǎn)子或(huò)相(xiāng)當的(dí)轉子
4. 特(tè)殊設備(bèi)
研缽和(hé)杵，用(yòng) DEPC 處(chǔ)理過(guò)的(dí)水(shuǐ)洗(xǐ)滌(dí)，預冷(lěng)
超速離(lí)心(xīn)管(guǎn)（異質(zhì)同晶(jīng)共聚材(cái)料），或(huò)相當(dāng)的 Polygon, 或(huò)相(xiāng)當的(dí)高速匀(yún)漿(jiāng)器(qì)

步(bù)驟

1，使(shǐ)用(yòng)研缽(bō)和杵在液氮下(xià)將(jiāng)樣(yàng)品(pǐn)研(yán)磨成細(xì)粉(fěn)。使用 Polygon 均(jūn)化(huà)器或(huò)其他(tā)合(hé)適的(dí)器具在(zài) 7 ml 胍(guā)裂(liè)解(jiě)緩衝液中(zhōng)均(jūn)質(zhì)化組(zǔ)織(zhī)或細胞（達 1X109 個(gè)）。
2，將 4 ml5.7mol/L 的 CsCl 溶(róng)液(yè)加到超速離心管中。
3，將(jiāng) 1ml5.7mol/L 的(dí) CsCl 溶液，120ul10mol/L 的沒-巰(qiú)基(jī)乙醇和(hé) 240ulN-月桂酰肌(jī)氨(ān)酸(suān)加到(dào)裂解(jiě)產物(wù)中(zhōng)。
4，將(jiāng)氯(lǜ)化銫(sè)/裂(liè)解(jiě)產物(wù)混(hùn)合物混(hùn)合，小心(xīn)使(shǐ)之位於離心管中(zhōng)的(dí)氯化銫(sè)溶(róng)液上(shàng)分層。
5，20°C 下 180000 g 離(lí)心 21 h。
6，移棄(qì)氯化銫(sè)上清液(yè)，小心(xīn)避(bì)免擾動(dòng)管底(dǐ)的(dí) RNA 沉(chén)降(jiàng)物。
7，小(xiǎo)心將(jiāng) RNA 沉(chén)降物再(zài)溶解(jiě)於(yú) 750ul 異硫氰(qíng)酸胍(guā)裂解(jiě)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)中。
8，加等(děng)體(tǐ)積酚，混匀。
9，10000g 離(lí)心 15 min。
10，將水相轉移(yí)到一(yī)新管中。重(zhòng)復(fù)水(shuǐ)相的酚(fēn)抽提，直(zhí)到界(jiè)麵變清(qīng)。
11，向清澈的(dí)水(shuǐ)相(xiāng)加 1 倍體(tǐ)積(jī)氯仿。
12，混(hùn)合(hé)，10000 g 離心 l0 min。
13，將水相轉(zhuǎn)移(yí)到一幹淨試管(guǎn)中。加(jiā)等(děng)體(tǐ)積(jī)的異丙酵和 1/10 體(tǐ)積(jī) 8mol/L 的(dí)氯化鋰(lǐ)。10000g 離心(xīn)10min。
14，移(yí)棄上(shàng)清液。用(yòng) 750ul70% 乙(yǐ)醇(chún)洗(xǐ)滌 RNA 沉降(jiàng)物，10000 g 離心。
15，移(yí)棄乙酵，風(fēng)幹沉降物，再溶解(jiě)於 50~500ul0.2 mmol/L 的 DTT 中。
16，RNA 儲存於-70°C。

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